Notizia

May 14, 2023

Rimodellamento strutturale del carbonio

Nature Communications volume

Nature Communications volume 14, numero articolo: 1001 (2023) Citare questo articolo

2243 accessi

32 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

In Escherichia coli, l'operone phn da 14 cistron che codifica la liasi carbonio-fosforo consente l'utilizzo del fosforo da un'ampia gamma di composti fosfonati stabili contenenti un legame CP. Come parte di un percorso complesso a più fasi, è stato dimostrato che la subunità PhnJ scinde il legame CP tramite un meccanismo radicalico, tuttavia, i dettagli della reazione non possono essere immediatamente riconciliati con la struttura cristallina di un nucleo liasi CP PhnGHIJ da 220 kDa complesso, lasciando una lacuna significativa nella nostra comprensione della degradazione dei fosfonati nei batteri. Qui, mostriamo utilizzando la microscopia elettronica criogenica a singola particella che PhnJ media il legame di un doppio dimero delle proteine ​​della cassetta legante l'ATP, PhnK e PhnL, al complesso centrale. L'idrolisi dell'ATP induce un drastico rimodellamento strutturale che porta all'apertura del complesso del nucleo e alla riconfigurazione di un sito attivo presunto legante il metallo situato all'interfaccia tra le subunità PhnI e PhnJ.

I batteri hanno sviluppato meccanismi elaborati per estrarre macronutrienti essenziali, come fosforo, zolfo, azoto e carbonio, dai loro ambienti. Nell'Escherichia coli Gram-negativi, la limitazione del fosfato induce il regulone Pho e l'espressione dell'operone phn a 14 cistron (phnCDEFGHIJKLMNOP), consentendo l'assorbimento e la degradazione dei fosfonati come fonte alternativa di fosforo1,2,3. I fosfonati sono strutturalmente simili agli esteri fosforici e ad altri metaboliti primari ma contengono un legame carbonio-fosforo (C–P) altamente stabile, resistente alla scissione idrolitica4. I fosfonati possono quindi funzionare come inibitori e analoghi dello stato di transizione e sono molto utili nell'industria come detergenti, erbicidi (ad esempio, glifosato/RoundUp®) e antibiotici5. L'operone phn codifica per un importatore di cassette leganti l'ATP (ABC) (PhnCE) e per una proteina legante periplasmatica (PhnD) per l'assorbimento dei fosfonati6, un regolatore trascrizionale (PhnF)7, oltre al meccanismo enzimatico completo (PhnGHIJKLMNOP) necessario per la degradazione e l'incorporazione nel metabolismo generale tramite il 5-fosfo-α-D-ribosil-1-difosfato (PRPP)8,9,10,11. La via C – P liasi ha uno spettro di substrati notevolmente ampio ed è in grado di gestire fosfonati alifatici e aromatici ingombranti10,12,13. Per questo motivo, e a causa delle numerose applicazioni dei fosfonati, esiste un forte e fondamentale interesse nella comprensione del meccanismo di degradazione dei fosfonati da parte della C – P liasi. Studi funzionali e meccanicistici dettagliati delle singole subunità enzimatiche codificate dall'operone phn hanno portato a un meccanismo di reazione proposto in cui la porzione fosfonata è inizialmente accoppiata all'ATP o al GTP attraverso lo spostamento della base azotata in una reazione catalizzata da PhnI e in presenza di PhnG, PhnH e PhnL8. È stato dimostrato che PhnM rilascia pirofosfato dal risultante 5'-fosforibosil-α−1-fosfonato per consentire a PhnJ di scindere il legame C – P attraverso un meccanismo di reazione strettamente anaerobico dipendente dal radicale glicina S-adenosil metionina (SAM). Infine, l'azione combinata di PhnP e PhnN converte il ribosio ciclico risultante in PRPP (Figura 1 supplementare)9,10.

A causa della complessità della reazione, del gran numero di subunità e complessi proteici coinvolti e del requisito anaerobico, tuttavia, non è stato ancora possibile ottenere una comprensione completa e meccanicistica della via C – P liasi. La struttura cristallina di un complesso enzimatico centrale, Phn(GHIJ)2, ha rivelato un etero-ottamero simmetrico costituito da un tetramero centrale compatto delle subunità PhnI e PhnG, ciascuna interagente individualmente con le subunità PhnJ e PhnH più distali14. Una caratteristica interessante di questa struttura è che il sito del cluster Fe4S4, presumibilmente richiesto per la formazione dei radicali e l'attivazione dell'enzima, si trova a una distanza significativa (30 Å) da un residuo di glicina in PhnJ, che è stato dimostrato dagli studi sullo scambio di deuterio essere la posizione stabile di un radicale tra i cicli di turnover enzimatico15. La struttura cristallina ha rivelato anche un altro presunto sito attivo all'interfaccia di PhnI e PhnJ contenente uno ione Zn2+ coordinato da due residui His conservati in PhnI, entrambi dimostrati essenziali per la crescita sul fosfonato. Infine, si è scoperto che dei due moduli ABC non trasportatori codificati dall'operone phn, PhnK e PhnL, una singola subunità di PhnK può legarsi a PhnJ attraverso una regione elicoidale conservata nota come dominio di inserimento centrale (CID)14. Nei batteri, i moduli ABC sono per lo più associati agli importatori di metaboliti dove interagiscono come dimeri con un dominio transmembrana per legare e idrolizzare l'ATP, generando così l'energia e il movimento necessari per il trasporto contro un gradiente di concentrazione16. La struttura dimerica generale dei moduli ABC offriva quindi poco per comprendere la funzione della singola subunità PhnK legata al complesso centrale della liasi C – P. Inoltre, questa discrepanza ha suggerito che la struttura osservata potrebbe non rappresentare un vero stato funzionale dell'enzima e non ha fornito una motivazione per la presenza dell'altro modulo ABC essenziale, PhnL. In questo lavoro, mostriamo geneticamente ed enzimaticamente che l'attività ATPasi sia di PhnK che di PhnL sono necessarie per la crescita di E. coli sui fosfonati e utilizziamo la microscopia elettronica criogenica (crio-EM) per rivelare un doppio dimero delle due subunità su C – P complesso centrale della liasi. L'analisi strutturale in condizioni di turnover dell'ATP rivela inoltre che l'idrolisi porta all'apertura del complesso del nucleo esponendo e riorganizzando il sito attivo Zn2+ situato tra le subunità PhnI e PhnJ.